TUhjnbcbe - 2021/4/19 20:45:00
总览：大家好，今天为大家分享一篇发表在Angew.Chem.Int.Ed.Eng.上的文章，文章的题目是“Chromophore-AssistedProximityLabelingofDNARevealsChromosomalOrganizationinLivingCells”，通讯作者是来北京大学化学与分子工程学院的邹鹏教授。邹鹏课题组致力于发展新型化学探针技术，为神经科学的研究提供新工具、新方法。他们一方面综合运用蛋白质工程、分子生物学和有机合成等手段创造新的功能分子，例如各类荧光探针、具有生物分子标记功能的酶及活性底物等；另一方面，结合光学、质谱、高通量测序等仪器技术，利用这些工具观测神经细胞的结构与活性，并通过数学建模对数据进行定量分析。在本文中作者发展了一种新的基于生色团辅助碱基光氧化的邻近依赖性DNA标记方法。通过将光敏蛋白定位到特定的亚核位置，利用生物正交功能手柄实现了蓝光激活的局部DNA标记，随后进行亲和纯化和下一代测序鉴定。作者运用这种方法揭示了核纤层关联域（LADs）覆盖37.6%基因组。这种简单的标记方法避免了化学交联的苛刻处理，一般适用于活细胞空间染色体组织的全基因组高分辨率映射。背景：真核细胞中的三维染色体结构对基因功能有着深远的影响。染色质结构失调与许多疾病有关，3D基因组的改变已被证明调控基因表达水平和细胞功能。研究DNA-蛋白质相互作用和染色质空间排列的传统方法，如染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq），通常需要甲醛介导的化学交联，这可能会引入偏差。此外，成功的免疫沉淀取决于对诱饵蛋白的特异抗体的可用性。最近，一种抗体靶向过氧化物酶介导的标记策略，命名为TSA-seq，被开发为苯氧自由基介导的邻近DNA生物素标记，它揭示了固定细胞中核纤层和核斑附近的染色质结构。这些方法各有优缺点。例如，TSA-seq需要细胞固定和膜通透性以允许抗体过氧化物酶结合物在细胞内递送。作者提出了一个概念上新颖的DNA接近标记技术，在活细胞中提供高空间和高时间分辨率。此方法建立在光敏DNA氧化损伤的基础上。在所有四种DNA碱基中，鸟嘌呤具有最低的氧化还原电位，并且容易被单线态氧（1O2）氧化产生一系列产物，包括螺氨酰二乙内酰脲（Sp）、咪唑啉酮（Iz）、恶唑酮（Oz）等。我们选择miniSOG作为光敏剂，miniSOG是一种最初来源于拟南芥光致变色素2的工程*素蛋白。因为它可以以蛋白质融合的形式遗传靶向特定的亚核位置。在蓝光照明下，miniSOG通过II型光反应产生1O2。而这种生色团辅助邻近标记策略已经由他们小组和其他课题组实施，描述RNA的空间结构。由于以下独特的原因，它不容易扩展到标记与染色质相互作用的DNA：1）与RNA相比，DNA的拷贝数低得多；2）双链DNA（dsDNA）与单链RNA相比反应性较低；3）核小体和高阶染色质结构保护DNA。这些挑战要求改进化学标记和分析方法。关键数据：本研究首先从体外研究miniSOG介导的DNA光氧化，通过超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）检测到Iz、Sp和Oz产物。鸟嘌呤核苷可以氧化结合到胺功能化分子，如赖氨酸和精氨酸。作者向反应混合物中加入苯乙胺（PEA），检测到氧化结合物Sp-PEA。另一个工程*蛋白SOPP2是miniSOG的一个突变体，提高1O2产率，也可以介导Sp-PEA加合物的形成。进一步利用上述光氧化反应将生物素共价连接到dsDNA上。通过斑点杂交法为生物素化读出，比较了几种生物素共轭胺探针，包括苯胺、烷氧胺和烷基胺。其中烷基胺在miniog介导的dsDNA光标记上表现出最高的反应性。最后作者发现炔丙基胺PA探针也可以被光氧化与dsDNA结合，随后与生物素衍生利用铜辅助炔叠氮环加成反应（CuAAC）。表明蓝光照射下miniSOG可以介导胺探针与dsDNA的光氧化结合。接下来，作者试图在细胞中测试发色团辅助dsDNA标记的效率和空间特异性。通过与融合COX4N端信号肽（mitominiSOG）、组蛋白2B（H2BminiSOG/SOPP2）、层粘连蛋白A（SOPP2-LMNA）和核仁蛋白（SOPP2-NCL）融合，miniSOG/SOPP2靶向于线粒体基质核质、核膜和核仁。在细胞内PA探针标记以后，裂解细胞，以提取基因组DNA，并且通过点击反应引入生物素手柄，这允许用链霉亲和素包被的珠对标记的dsDNA片段进行有效的亲和纯化。通过定量PCR（qPCR）分析富集片段。证实了生色团辅助DNA标记在活细胞中的高效性和高空间特异性。最后，作者应用这种方法分析了核周围的局部基因组序列。如下图所示：作者在HEKT细胞中表达SOPP2-LMNA。标记和亲和纯化之后，用NGS分析了富集的DNA片段。通过SOPP2-LMNA鉴定的LADs覆盖了基因组的37.6%；发现LAD富含异染色质标记H3K9me2，而缺乏与活性基因表达相关的组蛋白标记，包括H3K27AC、H3K4me3和H3K36me3。总结：这篇文章发展了一种研究活细胞染色质空间排列的新方法。基因编码的光敏剂miniSOG和SOPP2可以在弱蓝光下介导胺探针与双链DNA的光氧化结合。应用发色团辅助的DNA标记方法研究核层的局部染色质序列。与现有的分析与某些亚核结构相关的DNA序列的技术（如ChIP-seq和最近开发的TSA-seq）相比，此方法的一个显著优点是避免了化学固定剂，即当所有亚细胞结构都保持在其天然状态时，就可以DNA标记。另一个优点是其快速反应动力学，只需要在20-30mW/cm2中等强度的蓝光照射15分钟。作者希望发色团辅助的DNA标记可以广泛应用于分析核小体和亚核液态缩合物中的染色质组成。本文作者：ZYS责任编辑：ZWY原文链接：