研究对象：菊苣
发表期刊：frontiersinplantscience
影响因子：4.
作者介绍：美国佐治亚大学祁澎博士（Super-GBS技术顾问）参与发文
涉及的欧易生物服务产品：Super-GBS
●研究背景
菊苣是一种叶菜类植物，隶属于菊科菊苣属，由于其孢子体自交不亲和系统，是一种异花授粉的二倍体植物(2n=18)。此外，异花授粉还受到一些性状的推动，包括:(i)花形态物候学(即，花药先于雌蕊成熟，从而无法完成自交);(ii)异源花粉粒和花粉管的竞争优势(即花粉的基因型与父母本不同)。
基于分子标记的高密度连锁图谱在作物遗传学和基因组学研究中起着关键作用，其发展简化了质量和数量性状基因座(QTL)的研究。第一个菊苣的遗传连锁图谱覆盖cM,包含个SSR和41个EST标记。随后，核雄性不育(NMS1)位点和孢子体自交不亲和(SSI)位点被分别定位在根菊苣的第五和第二连锁群上。同时，雄性不育基因(MS1)被定位在叶菊苣的第4连锁群中。最近的研究，一个覆盖了cM的遗传连锁图谱被成功绘制，将其与莴苣的基因组进行同源比对共发现了27对可能的同源染色体片段，覆盖了11%的菊苣基因组和13%的莴苣基因组，为这两个物种的比较分析开辟了新的途径。
对于菊苣自交不亲和和雄性不育位点的遗传连锁定位不仅在了解开花植物中主要生殖障碍的遗传基础具有重要意义，而且在杂交F1品种的选育中，这些位点也具有潜在的应用价值。
●研究内容
本研究利用基于菊苣和莴苣中27个同源连锁群上的微卫星标记位点和叶菊苣基因组序列草图成功构建了叶菊苣的高密度连锁图谱，并精确定位了叶菊苣的雄性不育(ms1)位点。首先利用SSR和EST标记对ms1基因位点进行初步遗传定位后，然后采用基因分型-测序(GBS)方法缩小ms1基因的染色体位置，建立ms1基因饱和连锁群，筛选雄性不育的分子标记和候选基因，为之后的标记辅助育种和基因克隆建立良好的基础。
●实验材料
本研究通过田间试验，发现了一些与ms1位点表型相同的雄性不育突变体。为了最大限度地提高遗传多样性和多态性水平，将培育的菊苣种群中的雄性不育突变株(基因型msms)与当地野生菊苣中的雄性可育株(基因型MsMs)进行杂交。利用F1后代中杂合的雄性可育株(Msms基因型)进行自交，再将F2子代中的雄性不育子代(msms基因型)与F1后代中杂合的雄性可育株(Msms基因型)进行回交，得到由株单株组成的分离群体，其中雄性可育株与雄性不育株的比例为1:1。为进一步明确该基因，对个BC1的杂交群体进行了遗传连锁图谱定位分析。
图1为定位菊苣雄性不育基因而开发的育种群体示意图
●研究结果
1.基于SSR标记的雄性不育基因的遗传定位
基于之前研究以获得的菊苣的微卫星(SSR)标记，对株子代植株进行多重SSR基因型分析，初步筛选出两个与ms1位点紧密连锁的SSR标记(M4.12和M4.11b)，与ms1位点的距离分别为5.8cM和12.1cM。这些SSR标记在基因组中的比对结果证明了ms1位点被定位在菊苣图谱的第四连锁群上。
图2分子标记定位在连锁群4上，发现与叶菊苣雄性不育位点(ms1)相关。(A)连锁群4图谱。(B)三个SSR标记(红色)、一个来自MADS-box区域的CAPS标记(蓝色)和雄性不育基因位点之间的遗传距离。(C)连锁群9。基于44个BC1群体样本，使用测序基因分型(Super-GBS)方法构建。红色表示已用于第一次SSR方法的两个SSR，粗体表示与ms1位点距离≤3个重组子的13个SNP。(D)ms1位点周围的染色体区域。
2.通过GBS技术建立基于SNP的菊苣连锁图谱
利用GBS方法对BC1群体的22个雄性不育株和22个可育株组成的子代进行连锁分析，建立了基于SNP的菊苣遗传连锁图谱，并确定了与ms1位点相关的标记。该连锁图谱包含个SNP群集，分布在9个连锁群，总长度为1,cM。ms1位点与M4.10b和M4.12两个SSR标记一起被定位到该遗传图谱中的第9连锁群上，其中M4.12与ms1位点共分离，定位于ms1位点7.8cM处。另外，13个SNP位点与ms1紧密相连，其中7个SNP标记(T、T、T4、T、T、T和T)在44个BC1后代群体中与ms1共分离。
图3遗传连锁图谱构建
3.与ms1位点连锁的SNP位点的验证
通过对另外64个BC1子代(32个雄性不育子代和32个可育子代)的分析去验证了13个雄性不育相关SNP的位置。基于个子代的连锁分析，13个SNPs均定位在连锁群9的9.9cM区域，其中4个SNPs(T、T、T和T4)与ms1位点共分离(图2-D)。
4.MYB被筛选作为雄性不育的候选基因通过对菊苣和莴苣基因组的同源性比对
利用莴苣基因组作为数据库，对含有13个与ms1紧密连锁的SNPs的contigs进行比对，发现其中有10个同源性很高(E-value1E-20)，而且均位于5号染色体18Mbp的边缘区域。在莴苣基因组的同一染色体区域，定位了一个来自MYB家族的转录因子MYB，它是拟南芥花药发育所需的功能因子，编码一个参与四分体胼胝质溶解和小孢子外壁发育的转录因子，因此选择这个同源基因作为雄性不育的候选基因。选择8种菊苣品种(即4个雄性不育突变体ms1ms1和4个雄性可育自交系Ms1ms1)进行MYB基因的扩增验证，序列比对表明雄性不育突变体的第二外显子中检测到4个核苷酸(TTAA)的插入，这种多态性随后通过等位基因特异性PCR在64株BC1群体后代中进行了检测，发现MYB与ms1位点共分离。进一步研究表明该插入突变能够导致MYB在雄性不育突变体中提前终止翻译，引起翻译后的蛋白个氨基酸的缺失。
图4MYB基因的获得及插入片段标记PCR验证。(A)莴苣5号染色外围区域与菊苣ms1位点周围9.9cM的DNA区域之间的微中同线性表明MYB可能参与雄性不育。(B)8个MYB序列的比对。4个测序来自雄性可育野生型(WT)，4个测序自雄性不育材料(ms)，突出显示后一组的第二外显子中插入了四个碱基。插入引入了一个早熟的终止密码子，预测的蛋白质缩短了个氨基酸。(C)使用MYB等位基因特异性引物在雄性不育突变体(ms)、雄性可育野生型(WT)亲本和8个BC1子代植物的代表性子集(分离1Msms:1msms)中生成的AS-PCR图谱示例。
小欧解读
1.本研究是在菊苣上构建的第一个基于SNP的连锁图谱，并完成该物种不育性状的分子定位。
2.深入理解核雄性不育系统对于植物育种的开发极为重要，因为雄性不育是在作物中培育F1杂交品种的最有效方法之一。
3.MYB与ms1完全分离，进一步证实了它可能是导致菊苣雄性不育的原因。
文末看点
Super-GBS是基于GBS进一步发展出的简化基因组测序技术，其原理是使用限制性核酸内切酶将基因组DNA进行酶切，然后对酶切片段进行高通量测序，通过分析获得SNP信息并进行基因分型，是一种快速、简便、低成本的基因分型方法。
青岛欧易生物科技有限公司多年来，立足生命科学，开发特色技术，为农、林、牧、渔等领域科学家提供遗传及分子育种方向的高端特色技术服务。目前在简化基因组研究已有了成熟的技术方法，欢迎各位老师前来咨询噢~
●参考文献
PalumboF,PengQ,PintoVB,etal.ConstructionoftheFirstSNP-BasedLinkageMapUsingGenotyping-by-SequencingandMappingoftheMale-SterilityGeneinLeafChicory[J].FrontiersinPlantScience,,10:.