张博杜久林分别独立建立高效条件性基因敲 [复制链接]

近年来，随着以CRISPR/Cas系统为基础的基因组定点修饰技术的飞速发展，制备indel等简单突变体的应用已经较为成熟，但是条件性/组织特异性基因敲除、基因标记等复杂的基因组修饰往往需要进行靶向敲入（knock-in，KI），而这类应用仍然存在效率低、周期长等问题，从而严重制约了基因功能的深入与精细研究，以及CRISPR/Cas技术在疾病模型构建与基因治疗等的应用。同时，作为重要的模式动物，斑马鱼的条件性基因敲除技术仍不成熟，极大地限制了其基因功能研究。最近，我国学者在斑马鱼条件性基因敲除技术上取得了重大进展。

10月30日，北京大学张博团队在eLife杂志发表了题为“One-stepefficientgenerationofdual-functionconditionalknockoutandgeno-taggingallelesinzebrafish”的论文，通过设计正-负双元件供体（dual-cassettedonor）靶向插入策略和改进实验方法，在斑马鱼中利用非同源末端连接（NHEJ）途径在靶基因的内含子中通过一次插入同时引入两个loxP序列以及荧光蛋白报告基因，从而快速、高效地对目的基因实现了双功能遗传修饰，所获KI鱼系既可进行条件性/组织特异性敲除，又可达到基因/等位基因表达的活体标记与细胞示踪效果。

图1-A利用改进的正-负供体构建靶向tbx5a的双功能荧光转换KI鱼系

该论文设计的正-负供体（positive-negativedonor，PoNedonor）主要包含正元件（Po-cassette）和负元件（Ne-cassette）两个部分。正元件带有靶基因中靶点之后的第一个剪接位点和随后的所有编码序列，用来还原/维持靶基因的正常表达；同时通过2A肽段连接in-frame的荧光蛋白报告基因；正元件两侧分别引入一个同向的loxP序列。负元件紧随正元件和loxP之后，由串联的转录终止信号以及含有提前终止密码子的突变型外显子共同组成，以便有效地终止靶基因的转录和翻译。当正-负供体由CRISPR/Cas系统介导定点整合进入靶基因后，在正常情况下正元件表达，模拟野生型内源靶基因的表达和功能，负元件则不起作用；此时的KI鱼系表现为基因标记的效果。如果引入Cre重组酶，则正元件会被特异删除（荧光报告基因的表达随之消失），使负元件得以表达，从而造成靶基因功能失活，这样就可以实现对靶基因的条件性敲除。上述策略在斑马鱼心脏发育重要调控基因tbx5a和kctd10中得到了验证。

图1-B-C

更进一步，该论文提出了基因型标记（geno-tagging）或称等位基因标记（allele-tagging）的概念，即利用不同的荧光蛋白报告基因对不同的等位基因（“野生型”和“突变型”）分别进行标记，进而可通过荧光信号的组合区分不同基因型的细胞（纯合“野生型”、杂合子和纯合“突变型”）。为了实现这一效果，该论文对上述正-负供体进行了升级改进，在负元件中引入跟正元件不同的第二个荧光蛋白报告基因，建立了活体基因型标记技术。上述策略在斑马鱼tbx5a和神经嵴发育重要调控基因sox10中证明了可行性，成功实现了条件性基因敲除和基因标记的荧光转换（图1）。

图1-D

12月20日，中科院神经所杜久林课题组在ScienceChinaLifeSciences发表了题为“One-stepGenerationofZebrafishCarryingaConditionalKnockout-KnockinVisibleSwitchviaCRISPR/Cas9-MediatedIntronTargeting”的研究论文，建立了新的斑马鱼组织特异性基因敲除技术zCKOIS（zebrafishConditionalKnockOut-knockInSwitch），通过在基因内含子中进行Cas9定点操作，利用NHEJ的高效性，在基因内插入含有红色荧光蛋白指示的反向敲除标记序列和绿色荧光蛋白指示的正向敲入标记序列的供体质粒，结合组织特异Cre的表达，实现了可视化的组织细胞特异性的基因敲除。

图2构建hey2-zCKOIS斑马鱼品系并在血管内皮细胞特异性敲除hey2基因

与张博组论文不同的是，杜久林组论文巧妙地将含有两对突变型的LoxP/LoxP序列的元件（图2中的loxP/loxP-TagRFP-loxP/loxP序列）反向构建到含有正向敲入序列（图2中的E5-EGFP序列）的供体质粒中，并通过NHEJ的方式插入到hey2基因的内含子中，建立hey2基因的zCKIOS品系（Ki(hey2-zCKOIS）)。无Cre蛋白表达时，hey2基因的结构和功能完整，实现了绿色荧光在hey2基因中的敲入，从而显示了该基因的内源表达特征。此时实现了利用zCKOIS进行绿色荧光标记的敲入；然而，在启动Cre蛋白表达后，两对LoxP位点的DNA序列元件被Cre反转，反转后的序列通过剪接受体和hey2基因的前一个外显子（E4）结合，导致其缺失含有重要功能结构域的最后一个外显子(E5)，破坏了该基因的结构与功能，并且将被破坏的基因加上了红色荧光标签。因此，结合特异性的Cre表达，实现了利用zCKOIS进行特异性基因敲除。利用该技术，能够使得科研人员在荧光显微镜下直接通过颜色看到并判断该基因在细胞中是否被敲除，免去了通过处死样本进行PCR扩增测序后才能鉴定其基因型的繁琐操作。

上述研究成果，实现了一步法产生双色标记的敲入及条件性基因敲除品系，填补了一直无法高效地在斑马鱼上进行基因特异性敲除的空白，为斑马鱼基因功能的研究提供了重要的技术手段。

简单来说，上述两篇文章都是通过设计正-负供体实现还原內源基因表达和破坏內源基因表达的功能。不同的是，张博团队的正筛选标记被一对正向放置的loxP包围，Cre靶向后，导致正筛选标记丢失并破坏内源基因，表达负筛选标记；而杜久林组的负筛选标记被一对反向放置的loxP包围，Cre靶向后，导致负筛选标记颠倒，从而表达负筛选标记并破坏内源基因（图3）。

图3斑马鱼条件性基因敲除技术示意图

发表于eLife的论文，由北京大学李文渊博士、博士生张亚鸽和韩冰舟同学为该论文的并列第一作者，张博教授为通讯作者。该工作得到了国家重点研发计划、项目、国家自然科学基金、北京大学生命科学学院启东产业创新基金等经费的大力支持。该项工作已申报专利。

发表于ScienceChina-LifeScience的论文，由中科院神经所李佳副研究员，博士生*羽和顾珊烨博士为该研究论文的并列第一作者，博士研究生訾化星亦作出贡献，李佳副研究员和杜久林研究员为通讯作者。该工作得到了国家自然科学基金青年项目，上海市科技重大专项，中国科学院前沿科学重点研究项目、中国科学院战略性先导科技专项，中科院国际合作局国际合作项目，中国万人计划和上海市优秀学术带头人等项目的支持。该项工作也已申报专利。

据悉，在杜久林组论文投稿过程中，张博组的论文正好在线发表。因此，两个实验室可以说是各自独立建立了斑马鱼中基于内含子敲入的基因标记和条件性基因敲除技术。

篇外信息：上述2篇论文所产生的斑马鱼条件性基因敲除品系及工具质粒已经保藏于国家斑马鱼资源中心(