年10月7日，瑞典皇家科学院宣布，将诺贝尔化学奖授予法国埃马纽埃尔·卡彭蒂耶（EmmanuelleCharpentier）和美国詹妮弗·杜德纳（JenniferA.Doudna）以表彰她们开发出一种基因组编辑的方法——CRISPR/Cas9，再次将基因编辑推入大众视野。
其实从基因编辑方法被提出以来此领域就不乏热点，那么今天小编就带大家一起来探索一下基因魔剪的前世今生，以及时下的研发热点，看看什么方向适合你。
埃马纽埃尔·卡彭蒂耶（EmmanuelleCharpentier）和詹妮弗·杜德纳（JenniferA.Doudna）（来源：sciencebusiness）
基因编辑技术是一种通过使用靶序列特异性工程核酸酶来操纵真核基因组的新兴治疗手段，包括模型细胞系的开发、疾病机理的发现、疾病靶标的确定、转基因动植物的开发和转录调节。
由于基因编辑技术在促进基因组中序列的正确校正方面所具有的特殊优势，基于基因编辑的疗法正被积极地开发为治疗多种疾病的下一代治疗方法。到目前为止基因编辑系统历经3代，包括锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应子核酸酶（TALEN）和CRISPR/Cas9。
1.锌指核酸酶（zinc-fingernuclease，ZFN）
通常基因插入/删除步骤包括：（1）基因组的某确定区域双链断裂（DSB），（2）修正缺陷内源基因或引入外源基因，（3）DSB修复。
真核生物中的DSB修复有两种内源性修复机制：非同源末端连接（NHEJ）或同源直接修复（HDR）。NHEJ在生物体内发生频率高，但准确性低。为了降低非特异性突变，提高基因编辑保真度，研发人员开发了一种工程核酸酶——锌指核酸酶（ZFN）。
ZFN技术诞生于年，直到年，Bibikova等第一次用ZFN的方法通过在果蝇中成功突变了yellow基因。ZFN是Cys2-His2锌指蛋白（ZFP）和衍生自FokI核酸内切酶的非特异性DNA限制酶的融合蛋白，可靶向的DNA裂解试剂，已被用作基因靶向工具，ZFPs在真核细胞中很常见，并与转录调控和蛋白质-蛋白质相互作用相关。
ZFN的DNA结合域通常含有3个独立的ZF重复结构，每个ZF结构能够识别3个碱基，因而一个锌指DNA结合域可以识别9bp特异性序列，ZFN二聚体（含6个锌指）可以识别18bp长度的特异性序列。ZFN诱导的双链断裂易受细胞DNA修复过程的影响，从而导致靶向诱变和靶向基因的替换均以非常高的频率进行。目前最常用的ZF结构为Cys2His2锌指。
ZFN技术虽然实用，但易产生脱靶现象，因为ZFN作用需要两个FokI切割区域的二聚化，且至少需要一个识别单元结合DNA，一旦形成异源二聚体，就很可能造成脱靶效应，并最终导致DNA错配和序列改变，当断裂的数目超过了DNA的修复能力会产生较强的细胞*性。
ZFN另外一个缺点是亲和力不高，虽然经过优化设计后，用较短接头连接ZF模块可以提高其特异性，但利用此技术来获得高质量基因编辑产品还有较长路要走。
ZFN诱导双链断裂修复示意图[1]
2.转录激活子样效应子核酸酶（transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN）
继ZFN后，第二代人工核酸酶技术——转录激活子样效应子核酸酶（TALEN）于年诞生。TALEN作为ZFN的替代品与ZFN类似，包含与目的DNA结合域融合的非特异性FokI核酸酶域，该DNA结合结构域由高度保守的氨基酸重复序列组成，这些重复序列来自由*单胞菌细菌分泌的蛋白——转录激活子样效应物（TALE），包含33~35个氨基酸。
该技术利用TALE重复结构域中氨基酸序列与其靶位点核酸序列之间有着对应的「氨基酸—DNA」关系，从而能快速设计出特异性结合目的DNA的蛋白模块。目前，几乎所有工程TALE重复序列都使用四个具有高变残基NN、NI、HD、NG的域，分别识别G、A、C、T。
与ZFN相比，两者的成本都较高，TALEN的设计和使用相对简单，用时更短，虽然也存在脱靶效应，但TALENs比ZFNs特异性更高且细胞*性更小。但值得一提的是，TALEN比ZFN大，大概3kb的cDNA编码一个TALEN，而编码单个ZFN仅需1kb，这使得TALEN的递送更具挑战性。
a.TALEN示意图；b.TALEN结合并切割为目标DNA位点上的二聚体[2]
3.规律间隔成簇短回文重复序列（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，CRISPR）
CRISPR/Cas系统是第三代基因编辑工具，是一种原核生物的适应性免疫系统，是细菌和病*进行斗争产生的免疫武器，用来抵抗外源遗传物质的入侵，如噬菌体病*和外源质粒等。
简单来说，病*感染细菌后将自己的基因整合到细菌基因组内用以繁殖，并通常在复制完成后杀死宿主细胞，为了回避这个致命的威胁，细菌进化出了强大的适应性免疫系统—CRISPR/Cas，它由一系列高度保守的短DNA重复序列组成，通常为21~48bp的回文序列或短的反向重复序列，这些序列之间被称为间隔子的可变序列片段间隔开，通常介于26~72bp之间，CRISPR阵列的第三部分是前导序列，其位于第一个重复序列上游，富含AT，约为~bp，包括必需的启动子序列。
Cas的全称是CRISPRassociated，是CRISPR基因座相邻基因，编码Cas蛋白，Cas蛋白提供了从入侵元件中获取新间隔子并靶向入侵元件所需的酶促机制。
基于系统发生机制和特定Cas蛋白，CRISPR/Cas系统目前分为六种类型，I~III型是研究最多的。每种类型可进一步细分为不同子类型，如类型I由IA到IF类型组成。每种类型都由所谓的特征蛋白指定，该蛋白以特定类型保守，但Cas1和Cas2基因似乎是通用的，被发现存在于大多数CRISPR/Cas系统中。Cas3、Cas9和Cas10分别充当I，II和III型的标志蛋白。
CRISPR/Cas9是目前研究得最多也是应用最成熟的基因编辑工具。下面小编以CRISPR/Cas9为例，介绍一下CRISPR/Cas系统的防御机制。
4.CRISPR/Cas系统防御机制
4.1外源DNA捕获
当病*首次入侵宿主细菌并将DNA组注入细胞内部后，Cas1和Cas2蛋白将扫描这段外源DNA，识别DNA中的原间隔序列临近基序（protospaceradjacentmotif，PAM），并截取原间隔序列（protospacer）整合到CRISPR序列前导区的下游，随后DNA进行修复。
CRISPR/Cas系统捕获外源DNA[3]
4.2crRNA合成
CRISPR基因组由三个部分组成：tracrRNA基因、Cas基因、CRISPR重复序列和间隔区序列。当病*再次入侵时，这些三部分被转录为tracrRNA，Cas蛋白和pre-crRNA。
tracrRNA具有发卡结构，pre-crRNA是由整个CRISPR序列转录而成的大型RNA分子。随后，tracrRNA、pre-crRNA和Cas9形成复合物，并且由RNaseIII在重复序列处切割将pre-crRNA加工成crRNA，从而形成由crRNA引导的crRNA：tracrRNA：Cas9核酸内切酶复合物。
crRNA合成[4]
4.3靶向干扰
随后，Cas9/RNA复合物随机扫描细胞中的DNA，首先寻找合适的PAM，识别出PAM序列后，如果被扫描的DNA序列与crRNA靶序列匹配，则Cas9/RNA复合体将从PAM序列后的前10~12个核苷酸解开DNA形成R-Loop。随后，Cas9的HNH核酸酶活性将切割crRNA互补的DNA链，而RuvC活性将切割非靶链，从而沉默外源DNA。
5.CRISPR/Cas9系统的应用
第三代基因编辑技术CRISPR/Cas的出现为人类基因编辑提供了新的可能性，随着近年来分子生物学的快速发展，它已广泛应用于许多领域，特别是在遗传疾病治疗、疾病相关基因的筛选和检测、肿瘤治疗、动植物转化以及病原微生物的预防等领域具有巨大的潜力，可以有效改善人类的生活质量。
5.1遗传疾病的矫正
CRISPR/Cas9最受
